产品名称：pCR-BluntII-TOPO-ZNF541 (human) 质粒

产品规格：05ug 质粒干粉。收到产品后，请根据产品管壁标签确认产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

pCR-BluntII-TOPO-ZNF541 (human) 质粒扩增流程

1. **质粒干粉**（常温运输，存于-20℃，保质期90天，请务必进行单克隆培养，不要直接使用和测序）

收到质粒干粉后，请先以5000rpm离心1分钟，再加入20μl去离子水（ddH2O）以溶解质粒。接着取1支100μl感受态菌株在冰上解冻10分钟，加入2μl质粒后，冰浴30分钟，再于42℃热激60秒，最后在冰浴2分钟。此后的步骤需在超净工作台中进行无菌操作。

加入900μl无抗LB液体培养基，进行180rpm震荡培养37℃，为期45分钟。随后以6000rpm离心5分钟，保留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上（推荐使用我们提供的平板涂布专用玻璃珠）。将平板正向培养1小时后，再倒置37℃培养14小时（若要求是30℃则需培养20小时）。如果出现大量菌落，请将质粒稀释后再转化；若无菌落，则加入10μl质粒转化。请务必先进行克隆感受态转化，重提质粒后再导入表达感受态。

在LB液体培养基中挑取单菌落，添加相应抗生素，进行220rpm震荡培养14小时，依据实验需求及质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

其他产品形式说明

2. **甘油菌种**（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需先进行液体复苏后再进行四区划线并挑单菌落进行液体培养。

3. **穿刺菌种**（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）穿刺接种，液体培养后进行四区划线，再挑取单菌落进行液体培养。

4. **菌落平板**（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）直接挑取单菌落至液体培养基中。

5. **液体质粒**（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）可直接使用的单独提取液体质粒。

6. **滤纸质粒**（常温运输，存于-20℃，保质期90天，请务必进行单克隆培养，不要直接使用和测序）收货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加入100μl无菌水将滤纸浸湿并浸泡5分钟，吸取5μl质粒转化，进行离心全涂。

质粒提取步骤示例

实验原理：碱裂解法提取质粒依据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的拓扑学差异。在pH值120～125范围内，线性DNA双螺旋结构解开并变性。尽管此时共价闭合的质粒DNA的氢键被断裂，两条互补链仍然紧密结合。加入pH48的高盐乙酸钾缓冲液恢复中性后，共价闭合的质粒DNA复性迅速而准确，而线性染色体DNA的复性则较慢。这些线性DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀并被去除。

操作步骤

1. 准备20ml灭菌培养管，编号并分别加入8ml LB培养基和8µl相应抗生素。

2. 用10µl枪头挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡培养过夜（274rpm）。

3. 取2ml过夜培养的菌液，室温下以10000rpm离心2分钟，去上清；可重复此步骤，直至菌液离心完毕。

4. 在留有菌体沉淀的离心管中加入250µl BufferP1（含RNaseA），充分混匀以悬浮菌体。

5. 加入250µl BufferP2，温和上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；注意避免剧烈混合，以免降低质粒纯度。

6. 添加350µl BufferN3，立即温和上下颠倒混匀4~6次，产生白色絮状沉淀。室温下以10000rpm离心15分钟，转移上清液至洁净的吸附柱中，确保无沉淀和细胞碎片。

7. 继续用BufferPB和BufferPW洗涤，确保乙醇完全去除，增加下游实验的成功率。

8. 最后，将质粒重悬于BufferEB中并保存于-40℃。

**注意事项**：

1. 使用之前，将RNA酶加入BufferP1，4℃保存。

2. 预热BufferEB至65~70℃可提升提取效率。

如需了解更多关于质粒载体的资讯，请咨询尊龙凯时。